BD Pharmingen流式實驗方案試劑精選

BD品牌 流式抗體細(xì)胞亞群研究試劑 mouse篇

BD Pharmingen流式實驗方案試劑精選

BD Pharmingen為您提供輕松上手的實驗方案

常用Mouse Panel：

以561835為例：RM4-5單克隆抗體與大多數(shù)胸腺細(xì)胞、成熟T淋巴細(xì)胞亞群（即MHCⅡ類限制性T細(xì)胞，包括大多數(shù)輔助性T細(xì)胞和免疫抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）和NK-T細(xì)胞亞群表達(dá)的CD4（L3T4）分化抗原特異性結(jié)合。據(jù)報道，CD4還可在多能干細(xì)胞、骨髓和B淋巴細(xì)胞前體、胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞前體和脾臟樹突狀細(xì)胞亞群中檢測到。CD4在小鼠卵細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)，參與卵細(xì)胞與MHCⅡ類精子的粘附。CD4是T細(xì)胞表面的抗原受體，與抗原提呈細(xì)胞上MHCⅡ類分子相互作用。它通過與T細(xì)胞受體復(fù)合物和蛋白酪-氨酸激酶lck的結(jié)合參與T細(xì)胞活化。純化的RM4-5單抗已被報道能阻斷FITC結(jié)合的抗小鼠CD4克隆GK1.5和H129.19的結(jié)合，但不能阻斷RM4-4克隆。異硫氰酸熒光素FITC是一種分子量為389da的熒光色素。FITC對pH值變化和光漂白反應(yīng)敏感。由于幾乎相同的激發(fā)和發(fā)射特性，但溢出特性不同，F(xiàn)ITC和Alexa Fluor®488不能同時使用。FITC相對較暗，應(yīng)盡可能保留高表達(dá)標(biāo)記。

準(zhǔn)備和儲存

用親和層析法從組織培養(yǎng)上清或腹水中純化單克隆抗體。在條件下將抗體與FITC偶聯(lián)，去除未反應(yīng)的FITC。在4°C下未稀釋儲存，并防止長期暴露在光下。不要凍僵。

由于應(yīng)用不同，每位研究者應(yīng)滴定試劑以獲得結(jié)果。

抗體通過流式細(xì)胞儀分析進(jìn)行常規(guī)檢測。其他應(yīng)用在BD生物科學(xué)制藥公司僅在抗體開發(fā)期間進(jìn)行測試或在文獻(xiàn)中報告。

BD公司? CompBeads可以作為替代物來評估熒光溢出（補(bǔ)償）。當(dāng)熒光色素結(jié)合抗體與復(fù)合珠結(jié)合時，它們具有與細(xì)胞非常相似的光譜特性。然而，對于某些熒光色素，與細(xì)胞相比光譜發(fā)射可能存在微小差異，從而導(dǎo)致溢出值與生物控制相比有所不同。強(qiáng)烈建議用戶在*使用試劑時，比較細(xì)胞溢出和Comp珠，以確保BD Comp珠適合您的特定細(xì)胞應(yīng)用。

為獲得jia結(jié)果，建議在抗體染色后進(jìn)行兩次清洗。在流式細(xì)胞儀上采集細(xì)胞之前，可制備細(xì)胞，用抗體染色，并用洗滌緩沖液洗滌兩次，以進(jìn)行免疫熒光染色。執(zhí)行少于建議的清洗步驟可能導(dǎo)致陰性人群的傳播增加。

為了獲得jia和可重復(fù)的結(jié)果，在同一實驗中使用兩種或兩種以上的BD-Horizon亮色染料時，應(yīng)使用BD-Horizon亮色緩沖液。熒光染料相互作用可能導(dǎo)致染色偽影，從而影響數(shù)據(jù)解釋。BD-Horizon亮斑緩沖液的設(shè)計是為了小化這些相互作用。更多信息可以在BD Horizon Brilliant染色緩沖液（Cat）的技術(shù)數(shù)據(jù)表中找到。

此篇為您提供流式抗體細(xì)胞亞群研究試劑 human篇，用于人體細(xì)胞亞群的研究試劑

產(chǎn)品名稱：BD品牌 流式抗體細(xì)胞亞群研究試劑 mouse篇

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   流式細(xì)胞技術(shù)
流式細(xì)胞術(shù)工作原理是在細(xì)胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析。它可以高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點，是當(dāng)代xian進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一。
光源、液流通路、信號檢測傳輸和數(shù)據(jù)的分析系統(tǒng)是流式細(xì)胞儀的主要組成。目前臨床中運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行外周血白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等的檢測是臨床檢測的重要組成部分。流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物。1.使各種液體和懸浮細(xì)胞樣本新鮮，盡快完成樣本制備和檢測；2.針對不同的細(xì)胞樣本進(jìn)行適當(dāng)洗滌、酶消化或EDTA處理，以清除雜質(zhì)，使粘附的細(xì)胞彼此分離而形成單細(xì)胞狀態(tài)；3.對新鮮實體瘤組織可選用或聯(lián)用酶消化法，機(jī)械打散法和化學(xué)分散法來獲得足夠數(shù)量的單細(xì)胞懸液；4.對石蠟包埋組織應(yīng)先切成若干40-50um厚的蠟片，經(jīng)二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細(xì)胞懸液；5.單細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)不應(yīng)少于10000個。
流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用：
1.其測定細(xì)胞內(nèi)DNA的變異系數(shù)小，一般在2%以下；
2.能準(zhǔn)確地進(jìn)行DNA倍體分析；
3.借助于熒光染料進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的定量研究；
4.快速進(jìn)行細(xì)胞分選和細(xì)胞收集；
5.醫(yī)學(xué)應(yīng)用：免疫功能研究各種干細(xì)胞的檢測，癌癥病人的多藥耐藥性，細(xì)胞功能及代謝動力學(xué)研究，血小板分析（心血管疾?。魇郊?xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究；
6 應(yīng)用于外周血內(nèi)皮細(xì)胞測定、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等領(lǐng)域。用于臨床
流式細(xì)胞分析儀臨床用于細(xì)胞治療中心在FACSVantage革命化的細(xì)胞分選功能基礎(chǔ)上推出的分選增強(qiáng)（Sort Enhanced edition，SE），BD FACSVantage SE，其新功能和新配置通過與標(biāo)準(zhǔn)多激光多熒光系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的完-美整合，速度更快，功能更強(qiáng)，是當(dāng)今流式技術(shù)的體現(xiàn)。
當(dāng)前，臨床流式細(xì)胞分析已成為檢驗醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個熱點，其發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面。
一．從相對細(xì)胞計數(shù)到細(xì)胞計數(shù)
流式細(xì)胞分析大的優(yōu)點是對混合細(xì)胞群體中亞群細(xì)胞的計數(shù)，如淋巴細(xì)胞可依其表面標(biāo)志的不同分為T淋巴細(xì)胞（CD3+）、B淋巴細(xì)胞（CD19+）、NK細(xì)胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細(xì)胞又可進(jìn)一步分為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4-CD8+）等。這些亞群細(xì)胞計數(shù)過去多以相對百分比表達(dá)結(jié)果，由于百分比只能代表每種細(xì)胞在混合細(xì)胞群體中所占的比例，并不能體現(xiàn)其在單位體積血液中的數(shù)量，而對艾滋病等一些疾病的臨床診斷，有時需要考慮細(xì)胞的數(shù)量，如患者血液中T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）的數(shù)量<200個>200個/μL。T淋巴細(xì)胞亞群的計數(shù)在國外實驗室早已成為常規(guī)檢查，但在國內(nèi)僅有少數(shù)實驗室開展?？梢灶A(yù)見，隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，對造血干細(xì)胞等的數(shù)量分析，不久的將來，也將作為常規(guī)檢查項目，走出實驗室進(jìn)入臨床。
流式細(xì)胞計數(shù)在臨床可開展的項目包括：①淋巴細(xì)胞亞群，尤其是T淋巴細(xì)胞亞群的計數(shù)。②外周血或骨髓中造血干/祖細(xì)胞的計數(shù)。③血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的計數(shù)。④血液中血小板數(shù)量，尤其是血小板減少癥患者血小板的計數(shù)，此種計數(shù)優(yōu)于血細(xì)胞-分析儀法，已成為血小板計數(shù)的推薦參考方法。此外，可能出現(xiàn)在血液中的其它一些稀少細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞等）的計數(shù)，也將發(fā)展為流式細(xì)胞計數(shù)。流式細(xì)胞計數(shù)的開展對臨床疾病的診斷、治療等有重要意義。
二．從相對定量到定量分析
細(xì)胞的多種成分如某些抗原或受體表達(dá)的流式細(xì)胞分析，以前多以平均熒光強(qiáng)度（MFI）或相對熒光強(qiáng)度（RFI）表達(dá)其含量。由于流式細(xì)胞儀每次的儀器狀況可出現(xiàn)差異，每個實驗室所用儀器的類型也不盡相同，因此，以MFI或RFI表示細(xì)胞抗原或受體的表達(dá)量缺乏可比性，雖然流式細(xì)胞儀有*的熒光靈敏度，但卻無法準(zhǔn)確應(yīng)用這些信息。近年來，為了通過FCM精確定量分析細(xì)胞的某些成分，定量流式細(xì)胞術(shù)（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐漸得到發(fā)展，其定量分析原理主要有兩種：①定量抗體微球法：在特制的微球上包被已知分子數(shù)的羊抗鼠IgG分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子數(shù)的混合微球，此微球與待測標(biāo)本在相同條件下與熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）反應(yīng)后在流式細(xì)胞儀上測定其熒光強(qiáng)度，根據(jù)微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數(shù)和與之對應(yīng)的對數(shù)熒光強(qiáng)度計算回歸方程，再將待測樣本中陽性細(xì)胞的對數(shù)熒光強(qiáng)度代入方程即可求得其每個細(xì)胞上的平均抗原分子數(shù)（抗原結(jié)合位點數(shù)）。②定量熒光素分子微球法：在特制的微球上直接包被熒光素分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同數(shù)量熒光素分子的混合微球。
三．從單色到多色熒光分析
流式細(xì)胞分析已從初的間接免疫熒光染色、單色或雙色直接熒光染色，迅速發(fā)展到三色、四色甚至五色或六色熒光分析，使得對細(xì)胞亞群的識別和分選、細(xì)胞功能評價等更為精確。目前，淋巴細(xì)胞亞群的分析、白血病免疫表型分析，均應(yīng)使用至少三色以上的熒光分析才更可靠。例如：輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細(xì)胞白血病的異常淋巴細(xì)胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+。多色熒光分析是流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的必然趨勢，有條件時應(yīng)盡可能地采用。
四．從細(xì)胞膜成份到細(xì)胞內(nèi)成份分析
細(xì)胞膜免疫表型分析是重要的流式分析內(nèi)容之一，很多細(xì)胞亞群的檢測和分選均是以細(xì)胞膜的免疫表型特征為依據(jù)，如T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分析、白血病免疫分型等。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的，尤其對一些細(xì)胞的系列鑒定和功能狀態(tài)分析常常較為困難，而細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)成份的分析則更能反映某些細(xì)胞的系列特征和功能變化。隨著近年來細(xì)胞內(nèi)成分檢測技術(shù)的不斷完善，細(xì)胞內(nèi)成分檢測已成為流式細(xì)胞分析的又一個熱點。例如，急性髓系白血病性原始細(xì)胞漿中檢測到髓過氧化物酶（MPO）是zui為準(zhǔn)確的系列標(biāo)志，急性B淋巴細(xì)胞白血病性原始細(xì)胞胞漿中檢測到CD79a是zui為特異的系列標(biāo)志；檢測T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達(dá)，是判斷T淋巴細(xì)胞活化及其功能的重要手段，而且還能將輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（Th）進(jìn)一步分成Th1和Th2亞類，在Th1和Th2細(xì)胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通過細(xì)胞內(nèi)成分檢測技術(shù)與多色免疫熒光分析方法相結(jié)合，可檢測不同細(xì)胞亞群合成的不同細(xì)胞因子（Cytokine），如用五色疫熒光分析血液中淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑刺激后，輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞亞類—Th1細(xì)胞內(nèi)有細(xì)胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。
五．液體中可溶性成分的流式細(xì)胞分析
從傳統(tǒng)意義上講，流式細(xì)胞技術(shù)只能分析細(xì)胞及其成分，液體中的可溶性成分則不能進(jìn)行分析。然而，如果將液體中的可溶性成分結(jié)合在一種類似于細(xì)胞大小的顆粒（如乳膠顆粒）上，流式細(xì)胞儀便可以對其進(jìn)行分析，這就是近年來發(fā)展起來的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技術(shù)。CBA的原理是將包被某種抗原或抗體不同大小的微球與待測液體中的相應(yīng)成分反應(yīng)形成抗原與抗體的復(fù)合物，再加入熒光素標(biāo)記的第二抗體，微球上結(jié)合的待測抗原或抗體分子數(shù)量與其熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，由此可對待測液體中與微球上包被抗原或抗體分子相對應(yīng)的成分進(jìn)行定性或定量分析，例如同時測定血清或細(xì)胞培養(yǎng)液中的多種細(xì)胞因子，同時測定血清中多種自身抗體。CBA發(fā)展的時間雖很短，目前所能檢測的項目還不多，但其發(fā)展?jié)摿Σ蝗莺鲆?。已知檢測細(xì)胞因子的方法有多種，包括靶細(xì)胞功能分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、斑點酶免疫分析（Elispots）等，但CBA與之相比，其靈敏度*、可達(dá)2pg/ml，而且能同時測定單個標(biāo)本中的多種細(xì)胞因子。

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